热门:《自然》：低温留存技术多而杂，当前技术无法使人体恢复如初

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前言:人体低温保存作为有可能实现“复活”的新技术，受到了更多的关注。 就现在的技术来说，人体的低温保存就像是可以兑换成未来的支票。 人体的再温是极其多而复杂的过程，现在的技术手段无法使再温后的人体复原。 随着纳米技术、仿生低温保存技术等新技术的出现，人体低温保存的技术瓶颈有望在将来取得突破。 古代简单夺命的伤寒，现在可以用几片药片治好药片，随着医学的迅速发展，很多“不治之症”已经过去了，但如何才能让处于生命边缘的人吃“未来之药”？ 人们求助于人体的低温保存技术 年5月，因肺癌去世的展文莲在山东齐鲁医院和银丰生命科学研究院的共同合作下，完成了中国第一个人体低温残留，期待着将来用一定的科技手段“复活”，恢复健康。 不同冷冻速度下细胞低温保存人体低温保存低温生物学是研究低温条件下( 0℃以下或接近0℃)的生命现象及生物保存的科学。 1949年，英国生物学家保罗·杰( c. polge )和史密斯( a. u. smith )偶然发现精子在甘油溶液中低温冷冻未死亡，低温保存作为低温生物学的重要研究方向登上历史舞台。 低温保存是指用特殊的方法将活着的生物体(细胞、组织、器官乃至活着的生物)冷却到非常低的温度(通常为-80℃/-196℃)，短期/长时间保存，根据需要用特殊的方法解冻、解冻生物体 低温可以抑制机体的生化活动，在低温下长时间生存 根据阿伦尼斯的公式( arrhenius equation )，温度对生化反应速度的影响是，如果一生物体在4℃生存2小时，则可以在-40℃保存几天，在-80℃保存几个月，在-196℃保存几个世纪。 在-196℃的低温下，生物代谢几乎停止，没有发生遗传引起的生物变异。 随着科学技术的迅速发展更多的人希望通过人体的低温保存技术得到“永生”。 患有现代医学无法治愈的疾病的人，希望通过在低温下留下自己的身体(一般在-196℃液氮中)，在将来医学发达时康复，治疗自己的疾病，再次获得生命。 1967年，美国心理学家贝德福德( j. bedford )成为世界上第一个在低温下留下来的人。 年，中国作家杜虹在美国alcor生命持续基金( alcor life extension foundation )低温留脑，是第一个中国公民受到低温保留的例子。 年5月，中国第一次人体全身低温保存手术由银丰生命科学研究院完成 年8月至今，世界上最具代表性的两家人体冷冻企业美国alcor生命持续基金和美国人体冷冻机构( cryonics institute )分别冷冻保存了152 [1]和153 [2]名顾客。 但是，冷冻保存后人体的恢复成功，恢复生命的范例现在在世界上没有一例。 卵巢组织玻璃化冷冻前后的比较( a )玻璃化冷冻前； ( b )玻璃化冷冻后[8] 人体低温保留方案根据美国alcor生命持续基金会的人体低温保留方案[3]，理想的是，在人体心脏停止跳动后，等待的员工利用生命支持技术来维持大脑的活力。 这些生命支持技术包括将人体放入冰水浴(低温抑制新陈代谢)，人工恢复血液循环和呼吸，向大脑供给氧结合血，增强冷却。 通过静脉注射自由基抑制剂、抗凝药、升压药等保护药，保持血压，改善循环，抑制血液凝固，保护大脑 体温下降到接近水的冰点后，进行冷冻保护剂的注入。 迄今为止，为了清洗血液，在0℃以下将基础灌流液注入人体的血液循环系统，循环了几分钟。 为了使渗透压最小，提供足够的时间使冻结保护剂渗透到细胞内，在接下来的2个小时内使冻结保护剂的浓度以直线速度增加到目标浓度的一半，注入血液循环系统。 最后，冷冻保护剂的浓度在1小时内迅速增加到目标浓度。 注入冷冻保护剂后，系统在计算机控制下将人体在3小时内冷却到-124℃，以免形成冰晶。 在接下来的两周里，人体进一步冷却到-196℃，转移到液氮中长时间保存。 电影《宇宙旅行者》人体冷冻室人体低温保存的技术瓶颈生物可以在低温下长时间保存，但在冷冻和复温过程中非常容易受到损伤，这种损伤基本上发生在-60℃~0℃的温度范围内。 根据低温物理学家梅热( p. mazur )等人提出的“双因素假说”，常温下细胞内液和细胞外液处于等温和的等渗透状态，但在冷冻和复温过程中，根据传热和传递速度的不同，细胞冰晶形成的大小、形状、位置等不同，成对 冰晶穿刺、压迫细胞膜、细胞器等，同时细胞内冰的形成会使细胞内电解质浓度上升，改变ph，引起部分蛋白质的变性和溶酶体的损伤，最终导致细胞死亡。 因此，在不同生物体的低温保存过程中，有必要得到其“最佳冷冻速度”。 这个速度可以防止细胞内冰的形成，同时将“溶质的损伤”抑制在最小限度，提高细胞低温保存后的恢复率。 为了降低0℃以下冰的形成对生物体的机械损伤，冻结保护剂大多作为一定浓度的溶液来调制。 甘油是人类最初发现的冷冻保护剂，常见于早期冷冻方案。 但是，由于渗透速度慢，冷冻效果被忽视，逐渐被置换。 二甲基亚砜( dmso )是人类胚胎保存的第一种冷冻保护剂，渗透速度快，能更快地穿透细胞膜进入细胞内，降低冰点，延缓细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成 深低温时dmso的细胞毒性得到抑制，但超过4℃时长期暴露于dmso会损伤细胞，dmso会诱导干细胞分化[5]。 目前，研究者正在致力于慢速冷冻的迅速发展。 快速解冻方案可以代替dmso的冷冻保护剂。 例如，海藻糖对生物脱水防止、冷冻防止、高渗防止起着积极的作用，对生物膜、蛋白质、核酸等生物大分子也起着保护作用。 脯氨酸不仅能稳定生物的大分子结构，降低细胞的酸性，调节细胞氧化还原电位的汇，而且作为细胞的渗透型冷冻保护剂，能降低冰点，防止细胞脱水[6]。 因此，寻找生物友好型冷冻保护剂和合适的冷冻保护剂的组合对成功地实现机体的低温保存和复苏极为重要。 冷冻方法主要分为标准程序冷冻和玻璃化冷冻 近年来，玻璃化冷冻在残存过程中不生成冰晶，因此受到了更多的关注。 这是利用高浓度冷冻保护剂溶液的超速冻保存生物做法，只有在冷冻保存中实施快速降温和升温，才能实现成功的玻璃化冷冻。 目前，该技术在细胞规模上比较成功地实施 但是，如果生物体体积变大，则实施变得很困难 从阴茎生物传热方程( pennes bio-hent equation )可以看出，如果血液灌流率和人体代谢发热停滞，热流密度与热传导率和温差成正比。 人体组织的热传导率很小，所以大量的冷热迅速传递给人体，一定会产生很大的温差，最终生物内部的温度梯度增大，引起冰核的形成和生长。 另外，在复温时，在大体积生物体中容易发生再结晶 根据氙( s. seki )的研究，对于执行玻璃化冷冻的生物材料，在复温过程中减少重结晶的方法之一是提高复温速度，减少冻结保护剂在再结晶危险温度区域的时间，使冻结保护剂从玻璃化状态直接变化为液态 但是，同样由于人体的体积和热传导率的优点，这些难以实现。 在冷冻和复温过程中受到的双重破坏下，组织、器官及人体的低温保存极为困难。 对于细胞、组织和器官，人体的生命结构更多更复杂。 特别是人脑这样多的复杂结构，与1000亿个神经元连接着1万个神经，冷冻保存时容易受损，低温保存后的大脑是否会有记忆还不知道。 低温保存迅速发展的现状人体结构从微观到宏观分为细胞、组织、器官、系统和人体五个层面，低温保存的终极目标是实现人体长时间低温保存和恢复。 在现在的科学技术水平上，实现这个目标都很重要，道远，但低温保留行业依然有广泛的应用。 细胞的低温保存在医学中起着重要的意义 例如，人卵母细胞的冷冻作为保留生殖力的途径之一，在辅助生殖技术中发挥着不可或缺的作用。 卵母细胞的冷冻技术，特别是冷冻方法和冷冻保护剂，经过多年的迅速发展取得了很大的进步。 更多的实验研究表明，玻璃化冷冻具有更好的冷冻保存效果，古尔乔夫斯基( d. glujovsky )等人在年的研究中对106名患者进行了随机对照试验，结果表明玻璃化冷冻比慢速冷冻具有更高的妊娠率[7] 构成人体的细胞有200多种，细胞之间有很大的差异。 例如，每个细胞的体积不同，组织的渗透率和热传导性能也不同。 这样，最佳冷冻速度和冷冻保护剂也因细胞的种类而异。 由多种不同细胞构成的组织具有更多复杂的结构和更大的体积。 这无疑增加了组织在冷冻过程中热传播和保护剂传播的难度。 因为该组织的低温贮存比细胞的低温贮存效果差，难度大。 但是，随着近几十年低温生物传热研究的迅速发展，组织低温还留在医学行业，已经可以发挥一定的“拳脚”。 以生殖医学为例，2004年，多内( j. donnez )等人采用缓慢冷冻法保留了淋巴结癌患者的卵巢组织，解冻后实现了自体骨盆移植，最终使患者成功地生育了女孩。 根据银( s. silber )提供的数据，截至2005年，世界70多名婴儿依赖卵巢移植技术出生，其中银组共计进行13例卵巢冷冻移植手术，最终顺利产下9名婴儿，成活率超过70%。 但是，低温下残留的“威力”也不限于此。 对体外器官来说，现在只能实现短期保存，以临床保存经验最多的肾脏为例，机械持续低温灌洗法只能安全保存3天。 如上所述，如果样品体积大，在冷冻和复温的过程中热难以均匀导入，最终冷冻和复温的结果不理想。 年，比斯科夫( j. c. bischof )的研究小组在冷冻保护剂中加入被介孔二氧化硅复盖的氧化铁纳米粒子，通过高频激发加热，使样品整体的热更迅速且均匀，玻璃化冷冻的最高80毫升的物理系统和50毫米 比斯科夫说，这项技术克服了移植医学中的重大障碍，使器官低温保存成为现实，其应用前景非常乐观。 目前，动物器官相关实验已经在进行中，今后710年内人器官低温保存实验很可能开始[9]。 理论上，该技术可以实现冷冻器官整体的迅速复温，但需要进一步实验研究的问题很多。 经过数百万年的进化，许多生物体已经具备了机体抗冻的能力。 例如，拉纳西·巴蒂卡可以在低温下冻结到-16℃，在-4℃下可以忍受2个月的冻结期[10]。 面对寒冷刺激时，南极线虫( panagrolaimus davidi )能产生抑制稳定细胞膜海藻糖和重结晶的蛋白质，最高可耐受82%的体液冻结[11]。 这些现象通过研究在自然界中耐冻结生物体中使用的生物学机制，拓宽了寻找更好的冷冻保护剂和低温保存方法的研究者的想法。 10多年前，有科学家提出将冷冻保护剂载入机体，人为使冷冻保护剂参与机体的生命活动后，实施低温冷冻保存[12]。 研究人员在研究抗冻生物合成的抗冻蛋白等生物友好型冷冻保护剂的冷冻保护机制中，从生物(特别是抗冻鱼类、昆虫等)中分离纯化抗冻蛋白，用于低温保留行业，取得了理想的效果。 在一年的研究中，科研人员用富脯氨酸的食物饲养对寒冷敏感的黑腹果蝇( drosophila melanogaster )幼虫，使其组织蓄积脯氨酸，对这些果蝇进行低温保存实验。 结果表明果蝇在-5℃下能耐受约50%的体液冷冻，恢复后也对生命活动没有影响[13]。 借鉴动物天然的耐寒机制，效仿自然，迅速发展仿生低温保存技术，预计将成为今后突破人体低温保存技术瓶颈的最有希望方向之一。 总之，人体低温保留技术目前还不够成熟，尽管有更多的人体低温保留，但各大保留机构承认无法实现复活时间，要使复活成功不仅受到宗教、法律、伦理方面的挑战，而且受到很多科学技术的限制 现在，不仅要处理冷冻和复温过程中引起的细胞损伤、冷冻保护剂毒性等问题，还要探索合适的冷冻和复温过程，处理恢复后的生物学问题(如大脑记忆的恢复)，一步一步地从离体细胞、组织、器官、小动物、大动物的低温保留中深入 作者简介:中国科学院理化技术研究所低温工程要点实验室，窦蒙家，硕士研究生。 张明宽，硕士研究生饶伟，研究员刘静，研究员 参考文献:1. foundationalcorlifeextension.alcormembershipstatistics.2.insititutecryonics.cryonicsinstitutemembershipstatics na ensionfoundationhumancryopreservationprotocol ..4. martín-IBáez Raquel， hovalcorlifeextensionfoundationhumancryopreservationprotocol canalsjosepm.cryopreservationofhumanpluripotentstemcells:arewegoo . intech，.5.rao wei，黄海水，王海， et al.nanoparticle-mediatedintracellulardeliveryenablescryopreservationofhumanadipose-derivedstemcellsusingtrehaloss interface xue xu，yan jie，ET AL.l-Proline:Ahighlyeffectivecryoprotectantformouseocytevitrification.Scientific reports，6:26326。 riestra barbara，sueldo carlos， et al.vitrificationversusslowfreezingforwomenundergoingoocytecryopreservation.cochranedatabaseofsystematicreviews为9(9) : CD 010047.78.silber Sherman.ovariantissuecryopreservationandtransplantation:scientific implications.genetics，33 ( 12 ):1~9. 张锦金，ET AL.improvedtissuecryopreservationusinginductiveheatingofmagneticnanoParticles.sciencetranslationalmedicine : eaah4586.10.costanzojonp，reynolds alice m，amaral m，et al.cryoprotectantsandextremefreezetoleranceinasubarcticpopulationofthes 十(二) : e 011722 Wharton davida.theabilityoftheantarcticnematodepanagrolaimusdaviditosurviveintracellularfreezingisdependentuponnutriti parative physiology b，183(2): 181-188.12 .尤利纳，刘静.突破生物材料低温残存技术瓶颈的仿生学路径评价.科学技术导报，2005， 23() zahradníčková helena为ET AL.conversionofthechillsusceptiblefruitflylarva ( DrosoPhila Melanogaster ) toafreezetolerantorganism.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica，109(9):3270 (本文来自澎湃信息